研究案例|粪便病毒组移植减轻模式小鼠2型糖尿病和肥胖症的症状

Gut：粪便病毒组移植(FVT)对2型糖尿病和肥胖小鼠模型的缓解作用

近年来，粪便移植已成为治疗由梭状芽胞杆菌引起的严重腹泻的流行方法。最近，易基因科技合作方，丹麦哥本哈根大学Dennis Nielsen课题组在一项小鼠中进行的试验表明，通过粪便病毒组移植减轻肥胖症和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者的临床症状。

研究目的：

肥胖症和2型糖尿病（T2DM）的发生发展与肠道微生物群（gut microbiota, GM）的改变有关。噬菌体（phages）是一种以宿主特异性方式攻击细菌的病毒，其拮抗作用有可能改变肠道菌群，作为概念验证，Dennis课题组通过较瘦供体粪便病毒组移植（Fecal virome transplantation，FVT）将转变肥胖小鼠转变为较瘦小鼠表型，证明FVT对2型糖尿病和肥胖症干预的有效性。

实验设计：

图1：实验设计流程图。40只5周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠分为低脂（Low Fat, LF）饮食、高脂（High Fat, HF）饮食、HF +氨苄青霉素（ampicillin, Amp）、HF+Amp+FVT和HF+FVT 5组：（图1）。在13周内，小鼠被随意喂食HF饲料（研究饲料D12492，美国）和LF饲料（研究饲料D12450J，美国）。在不同方案喂食6周后，HF+FVT和HF+Amp+FVT组的小鼠分别用0.15 mL肠溶酶间隔1周（第6、7周）灌胃进行两次FVT,。第一次接种FVT前一天，HF+Amp和HF+Amp+FVT小鼠在饮用水中给予单剂量Amp（1 g/L）。从18只C57BL/6N小鼠的盲肠含量中提取并混合用于FVT的病毒体，这些小鼠代表3个不同的供体，饲喂LF饲料14周。来自不同供应商的个体小鼠代表了独特和多样的病毒概况。应用的FVT 病毒组的滴度约为2×1010病毒样颗粒/mL。在研究的第20周，对小鼠进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），并监测食物摄入量和小鼠体重。
项目流程：

结果：

1. 瘦供体FVT降低了DIO小鼠的体重增速，使血糖耐量恢复正常

小鼠分别在FVT前1-2周和FVT后间隔1-2周称量体重。在第一次FVT 后，第4和第6周（15、17周龄）时，HF+FVT小鼠（p<0.017）和HF+Amp小鼠（p<0.006）的体重增加明显低于HF小鼠（图2）。LF和HF+FVT小鼠OGTT无显著差异（p>0.842），而HF小鼠OGTT水平显著升高与LF组和HF+FVT组比较（p<0.0001），显示FVT已使HF+FVT小鼠的血糖耐量正常化（图2B）。此外，HF+Amp+FVT的OGTT与HF小鼠相当（p>0.999），说明在HF+Amp+FVT小鼠中，Amp对细菌组成的初始破坏有可能抵消了FVT的作用，。这同时表明，与FVT相关的影响是通过肠道菌群成分的改变而发生的。除糖化血红蛋白（HbA1c）水平和每只小鼠的食物消耗量外，还定期测定非禁食血糖。

图2. （A）第一次FVT后2、4、6周（分别为13、15、17周）体重增加的条形图。首次FVT后6周（17周龄）测定OGTT水平。数值是基于tAUC相对于单个小鼠的血糖水平。图中排除了第一次FVT后第4周和第6周两两比较的显著差异，以增加图像的可视性。*P<0.05，**P<0.006， ***P<0.0005, ****P< 0.0001。Amp，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著； OGTT， 口服葡萄糖耐量试验； tAUC， 曲线下总面积。

2. FVT增强了全身能量稳态相关基因的表达

以肝脏和回肠组织中与肥胖和T2D相关的基因为目标，检测HF+FVT与HF小鼠中相关基因的表达是否有显著差异，并与LF小鼠具有相似性。结果显示，FVT降低了HF饮食引起的基因表达差异，从而形成与健康LF小鼠相似的表达水平。

图3：肝脏和回肠组织中与肥胖和T2D相关的基因表达水平（18周龄）。（A）Ffar2Ileum，（B）LeprLiver，（C）KlbLiver，（D）Ppargc1aLiver，（E）Igfbp2Liver，（F）Socs3Liver，（G）MycLiver。采用以HF或LF为对照组的线性模型计算组间显著性。样本质检表达量的差异倍数取log2是对相对基因表达的一种度量，它是基于log2转化的表达值归一化到最小值的样本。Ffar2Ileum，游离脂肪酸受体；LeprLiver，胰岛素样生长因子结合蛋白；KlbLiver，β-klotho；Ppargc1aLiver，瘦素细胞因子受体；Igfbp2Liver，过氧化物酶体增殖物**受体γ共**剂1-α；Socs3Liver，细胞因子信号传导抑制因子；MycLiver转录因子。FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著。

3. FVT介导肠道菌群转移

盲肠样本16S rRNA基因拷贝数/g在1.46×1010 ~2.70×1010之间变化。LF小鼠的细菌Shannon多样性指数明显高于HF小鼠（p<0.005），但与HF+FVT小鼠相似（p=0.816）。与HF小鼠相比，盲肠中HF+FVT的Shannon多样性指数也显著增加（p<0.05），但在结肠中Shannon多样性指数没有明显增加。Amp治疗后7周，Amp处理过的HF+Amp小鼠的Shannon多样性指数最低（p<0.002），而FVT提高了Amp干预后的HF+Amp+FVT小鼠的Shannon多样性指数（p<0.016）（图4A）。FVT对病毒Shannon多样性指数无影响（p>0.59），而Amp的处理显著（p<0.003）增加了病毒Shannon多样性指数（图4B和线上补充表S5），其原因可能是由于噬菌体的诱导。

根据Bray- Curtis差异测定法，FVT对细菌组成（图5A, p<0.003）和病毒组成（图5B,P<0.001）都有强烈的影响，如HF+FVT与HF小鼠、HF+Amp+FVT与HF+Amp小鼠的明显分离。

FVT受体的GM特征与供体的GM特征不完全相似，这表明供体病毒组只有部分在接种6周后建立。此外，所有实验组在病毒和细菌群落中两两显著分离（p<0.003），包括LF和HF+FVT （p<0.001）。该研究发现，无论是否经过Amp处理，FVT都强烈地影响和部分重塑了GM的组成。rCCA表明，某些细菌（拟杆菌目和梭菌目）和病毒（尾病毒目，微病毒科和未鉴定的病毒）之间存在强（r>0.75）正或负相关性的潜在宿主-噬菌体对关系。

图4.供体和盲肠（A）细菌和（B）终止时（18周龄）的Shannon多样性指数。括号表示图中每一组的样本数量，灰色点表示异常值。供体是从三个不同供体的盲肠内容物中提取的细菌或菌体的1:1:1混合而成。各组的两两比较见线上补充表S5。*P<0.05。Amp，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。ns，不显著。

图5：PCoA图，基于Bray-Curtis不同度测量，取供体和盲肠（A）细菌群落和（B）18周龄病毒群落。Bray- Curtis不同度量的相似度分析（ANOSIM）显示在表中。供体是从三个不同供体的盲肠内容物中提取的细菌或菌体的1:1:1混合而成。各组的两两比较见线上补充表S5.Amp，氨苄青霉素；FVT，粪便病毒组移植；HF，高脂；LF，低脂。

图6.说明所有五个实验组细菌（A）和病毒（B）概况的热图，以及某些细菌和病毒簇之间的强烈相关性（C）。

4. FVT介导的血浆代谢组谱的改变

采用非靶向UPLC- MS分析血浆样品，测定FVT对宿主代谢组的影响。基于数据集建立了PCA模型，比较LF、HF和HF+FVT的概况（图7，所有组的在线上补充图S111）。与其他测量方法一致，HF+FVT小鼠的血浆谱位于HF和LF小鼠之间。两两建立OPLS-DA模型，所有模型（LF vs HF、LF vs HF+FVT、HF vs HF+FVT）均具有统计学意义（p<0.025），支持三组分离。在筛选出的VIP评分为>2的特征中，仅对与相关基因表达相关（基于rCCA）和细菌或病毒丰度相关的特征进行进一步检测以进行注释。研究的特征主要包括饱和/不饱和溶血磷脂（LysoPC）和/或磷脂磷脂胆碱（PCs），而其余的特征包括各种氨基酸或无法识别的代谢物。总体而言，与LF小鼠相比，HF小鼠的LysoPC（18:2）、LysoPC（22:2）、PC（16:0/22:6）水平更高，血浆LysoPC（22:4）和PC （18:1/O-18:2）水平更低。与LF小鼠相比，HF+FVT小鼠循环LysoPC（16:0）、LysoPC（18:2）和PC（16:0/22:6）水平升高，而LysoPC（22:4）和PC （18:1/O-18:2）水平降低。与HF小鼠相比，HF+FVT小鼠的LysoPC（16:0）、LysoPC（18:0）和PC （18:1/O-18:2）水平更高。

图7.PCA分析图，原始数据各维度和每个主成分的相关度由电喷雾电离（ESIZ）+UPLC-MS处理的终止妊娠（18周龄）时LF、HF和HF+FVT（R2=0.40和Q2=0.11）得到，表包括由两两比较生成的监督的OPLS-DA模型。HF，高脂；LF，低脂；OPLS- DA，潜结构正交投影判别分析；PCA，主成分分析；UPLC- MS，超高效液相色谱-质谱分析。

结论：

① 对高脂喂养的小鼠进行粪便病毒组移植（FVT），移植来源为来自低脂喂养14周的瘦小鼠的盲肠病毒组；② FVT 后第 6 周，受体小鼠的体重增长显著降低，且葡萄糖耐受性OGTT与瘦低脂喂养的对照组小鼠相似，没有出现发生因高脂喂养诱发引起的糖耐受损；③
与此一致的是，FVT 显著改变了小鼠的肠道细菌和病毒组成、血浆代谢物以及与肥胖和 2 型糖尿病相关基因的表达水平；④ 但在 FVT 前进行抗生素预处理，反而会削弱 FVT 的有益效果。这项研究说明，噬菌体介导的疗法或能用来治疗肥胖和糖尿病等肠道菌群相关疾病。

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