小鼠Lgr5味觉干细胞分化由来的味觉类组织具有味觉全能性
小鼠Lgr5味觉干细胞分化由来的味觉类组织具有味觉全能性
文献导读
味觉细胞，与消化管上皮细胞同样是由内胚层发育而来不断地重复细胞凋亡以及新生的细胞。一般味觉细胞指的是存在于口腔内、舌上皮味蕾中的细胞（后被考证口腔上颚以及咽头也存在）。口腔内存在的味蕾犹如洋葱状（Figure.1），内包含100到150个味觉细胞。甜苦鲜酸咸五种基本味被五种产生相应味受体的味觉细胞所感知，而后通过味蕾基底部存在的神经把味信号传导给大脑。
Figure.1 从形态学上分味觉细胞被分为四种类，并且都表达各自的标物。二型细胞表达G蛋白共轭受体（GPCR：guanosine-binding protein coupled receptor）的味觉细胞，与甜、鲜、苦相关。在二型细胞内，G蛋白作为最初的味刺激的转导分子将信号传至味觉神经，经由大脑反应。三型细胞与酸味的应答相关，咸味感知味觉细胞尚未完全解明，故在图中未标注。对一型细胞（支持细胞）的研究进展相对较慢，具体它与味觉受体的关系还有待研究者们的讨论。四型细胞是存在于味蕾基底部的细胞，被认为是分化为味蕾的味觉干细胞[1]。
文献内容
1.味觉干细胞的确定
使用Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）标识以及追踪味蕾中增殖的部位，通过放射自显影免疫染色发现大量的被标记的阳性细胞在味蕾基底部，并且这些味蕾细胞以存在于轮廓舌乳头的沟槽、叶状乳头的褶皱内居多。味蕾基底部的细胞在Brdu投药一小时后基本被标记，并随之向味蕾结构的顶端移动并于10日之后只有少数Brdu的阳性细胞留在基底部（Figure.2）。由此研究者们推论这些增殖旺盛且向外移动的味蕾基底部细胞应该就是味觉干细胞。
Figure.2 用BrdU荧光标记味蕾中的分裂细胞。
使用Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）标识以及追踪味蕾中增殖的部位，味蕾基底部的细胞在Brdu投药一小时后基本被标记，并且这些BrdU荧光标记细胞多存在于轮廓舌乳头的沟槽、叶状乳头的褶皱内。1、3、10天后的轮廓舌乳头的部位做切片进行观察，随着时间的推移，最初在味蕾基底部的荧光向外部移动并荧光消失，推测味蕾基底部细胞为味觉干细胞[2]。
2.Lgr5味觉干细胞筛选
研究者们先使用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠，通过流式细胞荧光分选技术（FACS）筛选了轮廓舌乳头处的带绿色荧光的Lgr5-EGFP+细胞（Figure.3A.B.C），并遵照Clever的培养方法[4]稍作改动后进行体外培养。
培养开始的第1，第2天时能够观察到绿色的荧光信号，随着味觉干细胞的渐渐分化绿色荧光也随之减弱（Figure.3D），但也有很少一部分味觉类组织仍留有绿色荧光（Figure.3E）。研究者们认为随着味觉干细胞的分化其表达Lgr5的该段序列会进入沉默状态，绿色荧光标记也随之消失，无法继续追踪分化细胞。Ren以及iwatsuki使用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠和Rosa26-tdTomato小鼠进行杂交，得到携带Lgr5-EGFP-ires-CreERT2和Rosa26-tdTomato(+/-)杂交型后代，利用抗雌激素药品他莫西芬（tamoxifen）诱导Cre重组酶去敲除Rosa26启动子以及Tomato之间的被Loxp夹住的终止子位点从而使Tomato荧光的序列能够表达。使用Cre-Loxp该系统来达到既确定Lgr5位点的表达又可以继续追踪分化后细胞去向的目的。在进行细胞分选前一天注射他莫西芬，诱导Tomato红色荧光表达。把两种荧光表达的细胞混合培养从而对比可发现带有红色荧光的味觉干细胞也和先前绿色荧光表达的味觉干细胞同样都分化成为味觉类组织，证明这些味觉类组织正是由Lgr5表达的味觉干细胞分化而来的（Figure.3F）[3]。
3.Lgr5味觉类组织能够响应促味剂刺激
Gustducin是一种特异性的味觉信号偶联蛋白，与其他G偶联蛋白一样由α、β、γ三个亚基组成。当与苦味、鲜味、甜味味觉受体结合形成配体后，α-Gustducin等蛋白被**，经过逐级的信号传递最终导致味觉细胞内细胞器膜上的IP3门控钙离子通道打开，引起胞质内钙离子浓度上升，从而利用钙离子成像设备可验证味觉类组织对促味剂的响应。
将味觉类组织移到2D平面培养基上进行两星期的培养。而后移到带有层黏连蛋白的载玻片上给予促各种促味剂。发现甜味（安赛蜜、三氯蔗糖），苦味（苯酸铵酰糖化物）均可引起钙离子应答（Figure.4A）。并且苦味浓度与钙离子浓度成正比，苦味应答可被磷酸酶Cβ2（phospholipase Cβ2）的阻断剂U73122所抑制[5]，证明味觉类组织的苦味应答的通路也是受Plcβ通路所调控的，经过一段时间后苦味被抑制钙离子响应又恢复正常（Figure.4B）。
在咸味应答方面，氯化钠和氯化钾都引起了钙离子的应答（Figure.5）。但是在鲜味（Umami）的应答方面，所有的味觉类组织中只有一个类组织应答了MSG：味精（Figure.6）。出乎意料的是，测试酸味应答的实验中味觉类组织有90%都引起钙离子的响应，但是却确导致了对其他味道不产生任何应答，作者推断这有可能是在不同质子敏感通道（Proton-sensitive channels）影响了其他味道对钙离子释放的刺激（Figure.7）。
未来展望
本文整理的味觉类组织都是基于啮齿类动物味觉干细胞培养而来的，灵长类与啮齿类在味觉受体的种类以及数量方面具有较大的差异。2017年3月东京农业大学岩槻健教授于东京农艺化学学会发表相关成果，成为世界首个利用灵长类味觉干细胞培养出灵长类味觉类组织的团队。相信今后人类味觉类组织的成功培养，将在食品新调味物质的开发，味觉衰退的再生医疗方面有长足贡献。
参考文献
[1] 味覚とGPCR Vol.50 No.9 2014 ファルマシア 887.
[2] 味幹細胞の探索から新規味蕾オルガノイドの作製まで 化学と生物Vol.54.No.8.2016 .
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