2020.8.26丨全长转录组测序产品概述

知识点梳理

全长转录组
- 测序发展史
- 测序原理
  - Sanger测序：毛细管电泳测序
  - illumina测序：制备文库、桥式PCR、可逆终止边合成边测序
  - SMRT测序：边合成边测序
- 二代拼接与组装
  - 二代测序：更多关注基因表达情况
  - 弊端：
    - 多倍体或杂合物种（无参）转录本拼接难
    - 无参转录组的定量准确性偏低
    - 无法准确检测可变剪接位点（假阳性较高）、APA、融合基因，基因家族
- 可变剪接
  - 概念：一个mRNA前体通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体。
  - 特点：时间和空间性在不同的组织、不同细胞，不同生理阶段或不同生理状态下均产生不同的剪接体 95%的人类基因可发生可变剪切
  - 形式：外显子跳跃、5'末端和3'末端可变剪切、内含子保留等植物中主要的剪接形式为内含子保留动物中则多为外显子跳跃
  - 重点：
    - 推广客户时，区分二代和三代测序的分析侧重
    - 二代测序注重差异基因的表达
    - 三代测序鉴定差异表达的转录本，更加精细
- 可变多聚腺苷酸化（APA）
  - 经典APA位点：AAUAAA
  - 影响：一个基因上有多个APA，可以产生多条不同长度3'UTR的mRNA，或产生不同编码序列的转录本
  - 特点：
    - 转录后修饰和调控方式
    - 不同物种间polyA尾的长度差异很大，如人平均250-300 个A，酵母平均70-80个A，拟南芥平均51个A
    - polyA太短的mRNA很容易被酶解或者处于翻译休眠状态
- 融合基因
  - 两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下,构成的嵌合基因。
  - 融合基因是由染色体重排产生的，包括染色体的易位，插入，颠倒，缺失等。
  - 融合基因的产生改变了基因的蛋白编码序列或调控序列，使得基因功能发生变化，对机体的影响较大:转录调控失调、生产嵌合体蛋白、基因截短等
- 三代全长概述
  - 利用三代测序平台对某一物种的mRNA进行测序研究
  - 可直接获得从5'端到3'端的高质量转录组信息而称为全长转录组测序全长转录组测序无需组装，直接获得单分子全长mRNA信息，同时可准确鉴定基因的可变剪接、可变多聚腺苷酸化（ APA）、融合基因、基因家族和非编码RNA等信息。
  - 三代测序平台
    - PB、Nanopore
PB概述
- PB建库原理
  - 芯片纳米孔决定了测序效率
  - 带荧光信号的dNTP在孔中合成序列，同时荧光信号完成测序功能
- PB平台比较
- 仪器试剂更新
  - 测序读长长
  - 产出数据量提升
  - 准确性提高
  - 支持barcode
- Sequel Ⅱ引进
  - 测序读长长
  - 产出数据量提升：~300 Gb
  - 准确性提高
  - 支持barcode，12个
  - 价格降低
Nanopore概述
- 发展历程
  - 中国大陆首家ONT官方认证——RNA测序资质
  - 也是中国大陆唯一一家通过ONT官方认证
  - 全球通过ONT官方认证的共15家，分布在美国、法国、荷兰、日本、新加坡、台湾等。
- 测序原理
  - Oxford Nanopore Technology（ONT）概念于上世纪80年代便被提出
  - 2014年，ONT对外提供MinION试用项目计划
  - 2016年，Nanopore平台通量提升，错误率显著降低
  - DNA/RNA分子上接马达蛋白（解旋酶）并附着在纳米孔蛋白上 u Oxford Nanopore Technology（ONT）概念于上世纪80年代便被提出
  - 2014年，ONT对外提供MinION试用项目计划
  - 2016年，Nanopore平台通量提升，错误率显著降低 l 纳米孔蛋白插入由人工合成的多聚物形成的膜中，薄膜的两侧浸没在含有离子的水溶液
  - 产生电势，形成特征性离子电流变化信号
- 碱基判读
  - uNanopore的碱基判读是依据其电流信号产生
  - 蛋白Pore狭窄处的纵向长度为大约5个碱基，某时间点测到的电流信号，为5个碱基共同作用的结果
  - Nanopore平台下机数据格式为FAST5格式，需要转化为FASTA和FASTQ格式再进行后续分析
  - 通过“递归神经网络（Recurrent Neural Network）”的复杂算法对碱基进行判读。使用 MinKnow进行数据处理
- 三种RNA建库测序方式区别
  - Direct RNA：针对RNA测序
    - 用于修饰研究，如RNA甲基化
    - 不足：成本较高
  - cDNA-PCR
    - 建库更加稳定，适合差异基因，定量研究
  - 基于cDNA测序
- 优势
  - GC含量偏好性较低
产品分类
- Nanopore要求有参物种
  - 已测序物种(species)：人、鼠
  - 动物(animals): 鸡、牛、羊、猪等
  - 植物(plants): 拟南芥、小麦、茶树、水稻等
  - 水产(aquatic products): 仿刺参、鱼、虾等
- ONT全长转录组优势
  - 定量更准
    - GC偏好性低
    - 转录本水平定量（二代是基因水平定量？？？）
    - 数据饱和（与PB相比，PB的饱和度低，无法定量）
  - 定量和定性到的转录本种类更多，有利于后期深入验证，发表多篇文章
  - 发表文章速度快，IF至少4分以上（PNAS、BMC Genomics、J MOL DIGNA、Frontiers系列，SR等）
  - 目前还没有成功案例
- PB产品
  - 有参纯三代，有参2+3
  - 无参纯三代，无参2+3（Only PB）
- 技术比较
  - ONT不包括SNP和Index分析
- 可推广客户
  - 对三代测序比较了解此类客户之前有类似研究，或是同课题组或同院系有类似研究，对三代研究内容比较了解
    - 1) 定量和定性到的转录本种类更多，有利于后期深入验证，发表多篇文章
    - 2) 单样品的可变剪接、APA、融合转录本等结构鉴定更准确，可准确鉴定到不同时期不同状态下单个样品特异和差异的结构
    - 3) 单样品的转录本定量更为准确。Pacbio的2+3，使用二代辅助定量，存在多比对效率问题（ONT，0%；二代约20%），而ONT可直接对转录本进行定量，结果更准
  - 对三代测序只是泛泛了解，听过但未接触过
    - 1) 新技术，蓝海，可发挥的内容多，适合短平快发文章，不需功能验证
    - 2) 发表文章速度快，IF至少4分以上（PNAS、BMC Genomics、J MOL DIGNA、Frontiers系列，SR等）
    - 3) 有二代测序技术项目经验
- 不做客户
  - 无参物种不接； ONT辅助注释基因组，做二代测序
  - 样品送样量最低起始量在1μg以下
  - 科研经费测序经费有限
  - 只关心表达量仅单纯利用少数的科研经费，发表期刊论文，不追求高分
  - 科研水平较差只做过普通转录组，且售后一堆问题；未曾接触过其他二代测序技术，未曾听过或了解过
  - 生产应用团队生理生化指标测定、表型研究团队，未接触过任何二代测序技术
- 客户定位
  - PB
    - 无参客户（植物、水产等）
    - 混样研究，二代和三代联合分析
    - 对碱基准确性特别关心的
    - 关注SNP和Indel
    - 保守派，不喜欢挑战的
应用方向
- 三代能做结构分析
  - AS、融合基因（农学较少）、lncRNA、基因家族、APA
- 方案设计
  - 背景调研
    - 确定物种是否有参考基因组；
    - 出现什么性状（抗旱、耐盐、颜色、产量）；
    - 研究进展，进一步引出本项目的研究意义和创新之处
  - 实验设计
    - 通过文献调研，推荐样品取材部位、处理方式或发育阶段的选择；
    - 前期验证实验、生理指标的测定方案等；
    - 生物学重复确认、测序策略；
    - 绘制技术路线

2020.8.26丨全长转录组测序产品概述

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