2020.9.15丨细菌&真菌基因组测序原理
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2025-02-16 12:26:46
- 细菌基因组测序原理
- 细菌定义：
- 属于原核生物，无核膜、DNA裸露，分真细菌和古细菌两大类的微生物。是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。
- 细菌基因组特点：
- 基因组：一般在0.16- 13Mb，大部分在5M左右；
- 编码序列：占总长度的90%，基因平均大小为 1kb；
- 细菌基因组产品类型、
- 产品列表
- ONT测序平台通量高，成本低（混样建库加Barcode：一个Cell混12---24个样儿）
- 细菌泛基因组：
- 细菌泛基因组：同种细菌不同菌株所有遗传信息的集合，包括核心基因和附属基因
- 核心基因：细菌内大多数菌株都存在的共有基因，这些基因决定了所有个体的基本功能
- 附属基因：细菌群体中，某些菌株特有的基因，决定了这些菌株特有的表型及功能
- 研究流程
- 研究思路
- 同属不同种：
- 遗传多样性高，不同菌种间形状或者功能差异较大，同一菌种不同株系多样性同样较高，寻找物种特有的功能基因。
- 同菌种不同亚种：
- 基因组变异快，同一菌种不同株系间基因序列或基因差异较大，如有毒株和无毒株，揭示毒性差异的原因。
- 细菌基因组完成图产品思路（2+3）
- 材料选择
- 单菌落、无污染
- 送样要求
- v 菌体送样：
- ① 显微镜下观察细菌生长状态，收集对数期的细菌。OD值=0.5~0.6
- ② 将适量（5ml）体积的菌液转移至2mL旋盖尖底离心管中，于室温下14000xg离心1min。
- ③ 弃尽培养基，将细菌沉淀迅速置于液氮中冷冻1h，转移至-80℃或液氮中长期保存。
- v 细菌泛基因组/细菌框架图（浓度：≥50ng/uL，总量≥2ug）
- v 细菌完成图Pacbio：（浓度：≥20ng/uL，总量≥15ug）
- v 细菌完成图ONT：（浓度：≥60ng/uL，总量：1-2ug）
- OD260/280=1.8~2.0，OD260/230=2.0~2.2，无单链DNA、RNA、蛋白等杂质污染
- 数据分析
- 技术路线图
- 功能基因注释
- 通用数据库：GO, KEGG, COG, Swiss-prot, Nr, pfam
- 专有数据库：CAZyme，ARDB，PHI，VFDB
- 比较基因组：
- 基因家族分类；特有和共有基因检测；快速进化基因检测；物种间进化关系分析；共线性分析
- 真菌基因组测序原理
- 真菌基因组
- 真菌基因组主要指各种真菌，包括各种酵母（约18M），霉菌，食用真菌等。一般在10M-150M，大部分是50M左右。复杂真菌有多核，杂合等现象
- 真菌基因组产品类型
- 产品类型图
目前微生物事业部完成的Hi-C项目：白灵菇、木霉菌、酸腐菌、酵母、炭疽菌
- 真菌基因组调研图
- 基因组调研图信息分析流程
- Kmer分布图
- 真菌基因组精细图分析流程
- 技术流程图
- ONT真菌精细图承诺contig N50≥2M，实测数据contig N50＞9M
- 真菌基因组送样要求
- v菌体送样
- ①大型真菌：从菌体上取生长旺盛的组织，无菌水冲洗干净，75%乙醇冲洗，吸水纸吸干样品表面；若组织体积大，应剪切成小块儿，保存于无菌2mL离心管中液氮冻存1h，-80℃保存，干冰运输。组织样品要求：>10g
- ②微型真菌或酵母菌：显微镜下观察真菌生长状态，收集对数期的真菌。OD值=0.5~0.6，将适量（10--20ml）体积的菌液转移至2mL旋盖尖底离心管中，于室温下14000 g离心 1 min；弃尽培养基，将真菌沉淀迅速置于液氮中冷冻1h，转移至-80℃或液氮中国长期保存；干冰运输
- v真菌HIC送样要求
- 2、活体培养在液体培养基中，根据菌体的生长习性和运输距离，结合老师的经验选择冰袋或者常温运送，保证菌体存活
- 3、冻存菌体为液氮速冻（将菌体转移至离心管中，然后将离心管放置于液氮中完成速冻），干冰运输
- 4、大约0.5g菌体/1个文库，最好提供1g以上的菌体
- 5、不需要老师提供培养基配方，不提供接种、转板等服务
- 6、样品到后，如果没有及时下实验任务单，实验室对于冻存样本提供-80℃保存，对于活体样品提供4℃或常温保存。
- DNA样品：（Qubit）
- 真菌调研图：（浓度：≥30ng/uL，总量≥2ug）
- 真菌精细图Pacbio：（浓度：≥20ng/uL，总量≥15ug）
- 真菌精细图ONT：（浓度：≥60ng/uL，总量：1-2ug）
- 微生物基因组应用
- 耐药性研究
- ARDB、CARD等抗生素抗性基因注释、分泌蛋白研究
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