ISME：基因组和转录组分析深海古菌Thermoprofundales
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本研究通过对MBG-D古菌进行宏基因组和宏转录组分析，发现其是全球沉积物中分布最广、丰度最高的古菌类群之一，具有特定混合营养代谢能力。在全球范围内，MBG-D古菌和其他深海古菌可能协同转化海洋深部有机质，在沉积碳循环中发挥重要作用。研究还首次提出了新的古菌目Thermoprofundales，归属于Thermoplasmata纲。
从基因组和转录组分析
深海古菌Thermoprofundales(MBG-D archaea)的生态和代谢
Genomic and transcriptomic insights into the ecology and metabolism of benthic archaeal cosmopolitan, Thermoprofundales (MBG-D archaea)
作者：Zhichao Zhou, Yang Liu, Karen G. Lloyd, Jie Pan, Yuchun Yang, Ji-Dong Gu & Meng Li
时间：2018.12
期刊：ISME
IF: 9.52
DOI: 10.1038/s41396-018-0321-8
摘要
深海古菌Group D (MBG-D)于几十年前在16S rRNA基因调查中发现，具有重要的生态学意义，但其尚未得到充分研究和培养。本研究通过对MBG-D古菌的16S rRNA基因进行综合Meta分析，发现MBG-D古生菌是全球沉积物中分布最广、丰度最高的古菌类群之一，共包含16个亚群。
共现网络分析表明，MBG-D古菌与Lokiarchaeota 和Hadesarchaea之间存在显著的非随机关联，表明这些古生菌群之间有着潜在的相互作用。同时，通过从红树林和潮间带泥滩沉积物中重建的4个近乎完整的基因组(MAGs)及其对应的转录组分析，对MBG-D古菌的代谢潜能和生态功能进行了深入研究。MBG-D古菌能运输和吸收多肽，并通过发酵产生醋酸和乙醇。宏转录组数据分析显示乙酸盐、氨基酸利用基因和肽酶基因，尤其是M09B型细胞外肽酶(胶原酶)在所有4个红树林MAGs中均有高表达。除了异养核心碳代谢，MBG-D基因组可能还编码两条自养途径的基因:以四氢甲烷蝶呤和四氢叶酸作为C1载体的Wood-Ljundahl (WL)途径，以及一个不完全的二羧酸/4-羟基丁酸循环，该循环在二羧化过程中由丙酮酸绕过苹果酸/草酰乙酸。
这些研究表明，MBG-D古菌是一种重要的普遍存在的深海沉积古菌类群，具有特定混合营养代谢，因此我们提出了Thermoprofundales这个新目，归属于Thermoplasmata纲。在全球范围内，Thermoprofundales和其他深海古菌可能协同转化海洋深部有机质，在沉积碳循环中发挥重要作用。
研究背景
古菌在全球生物地球化学循环中扮演着重要的角色。最新研究表明，海底沉积物中存在大量的古菌，Marine Benthic Group B (MBG-B), Marine Benthic Group D (MBG-D) 和深古菌（Bathyarchaeota）是其中的优势类群，可能对生物地球化学循环有重要的贡献。通过长期的16S rRNA基因分析发现，MBG-D古菌的全球分布和高丰度使它们成为陆地和海洋地下区域的普遍参与者，同时也表明MBG-D古菌具有特定的环境生态位和共生模式。近年来，利用单细胞基因组和宏基因组方法研究了MBG-D古菌的基因组和代谢途径。MBG-D古菌被认为是底栖厌氧古菌，能够进行外源蛋白矿化和乙酸生成，在海洋沉积物中分泌活性的细胞外肽酶。此外，一项宏基因组研究显示，MBG-D古菌和Bathyarchaeota共现于的白橡树河口沉积物中，且具有很高的丰度，同时在河口富含有机质的区域内，它们具有类似的乙酸生成和蛋白质降解代谢能力。由于它们在碳转化和普遍分布中的潜在重要性，对MBG-D古菌的生态、基因组和代谢进行更广阔和深入的了解非常重要。然而，仅少数可用的基因组限制了我们对其全球生态作用和代谢过程的全面理解。尽管MBG-D古菌已被鉴定多年，但MBG-D古菌的生态多样性、基因组图谱、代谢特性和生物地球化学功能仍不清楚。
本文以MBG-D古菌16S rRNA基因序列为基础，对其全球环境分布、不同亚群的环境关联以及与其他古菌类群的潜在协作关系进行了多宏组学分析。此外，研究者还从香港米埔自然保护区的红树林和潮间带滩涂的表层沉积物宏基因组数据中拼接得到四个完整的MBG-D基因组，并从公共数据集中得到一个附加的MBG-D基因组。这些基因组及其宏转录组分析更好地解释了MBG-D古菌的活性代谢和生态功能。根据其独特的系统发育位置和代谢潜力，作者提出MBG-D古菌为 Thermoplasmata纲中的新目Thermoprofundales。最后，研究者还讨论了分布模式与代谢能力的关系，并提出了这些普遍存在的沉积古菌在碳循环中的潜在生物地球化学作用。
样品采集
从香港米埔自然保护区采集沉积物。从红树林覆盖区采集了1份表层沉积物样品（MaiPo-8，深度为10～15cm），和1份较深的沉积物样品（MaiPo-9，深度为20～25cm）。另外从附近的潮间带泥滩采集了1份细泥浆样品(MaiPo-11，深度为13-16 cm），比前两份沉积物样品更均匀、氧化还原态更低。
保存底泥样品用于后续DNA提取。
主要分析点
1、MBG-D古菌16S rRNA基因序列的系统发育分析
2、宏基因组组装、分箱和网络分析
3、宏转录组分析
注：篇幅所限，详细实验和分析过程参见原文，不便之处，敬请谅解！
结果讨论
1. MBG-D古菌的生态学意义
将508个OTU代表序列以97%的相似度进行合并，重建MBG-D古菌的系统发育树，其中91.5%的序列被分配到16个亚群（图1a）。从内到外，第一环表示25个环境类别，第二环表示盐度，第三环表示渗透环境条件。MBG-D古菌分布广泛，16S rRNA基因序列来源于25个环境类型。其中，前3位最丰富的环境为海洋沉积物、海洋热液口和红树林沉积物，约占目前数据库中可用的总序列的70％。与盐度和渗透条件相关的指示谱系被用来绘制直方图，以描述所有研究样品中它们的丰度模式（图1b，c）。盐分和渗透条件下亚群的显著分离与早先关于Bathyarchaeota的研究一致，其中在淡水和海洋沉积物中发现了独特的进化型Bathyarchaeota亚群，表明了特定的生态位适应。
图1 Thermoprofundales的系统发育树（a）
和与环境相关的指示谱系的相对丰度（b，c）
2. 沉积物MBG-D古菌的Meta分析
从177项研究中收集到23194个沉积物古菌序列（每个研究至少包含30个序列），分配到36个古菌类群，绘制物种丰度分布图（图2a）。具有显著性支持的线性回归表明，广泛分布的古菌类群比有限分布的古菌类群具有更高的丰度。古菌类群可分为出现75次以上或75次以下的两类，其中一组为持续/高丰度分布的普遍存在类群，另一组为稀有/低丰度分布的类群（图2a）。MBG-D是第二常见的古菌类群，在177个样品中出现了124次，其16S rRNA基因序列相对丰度达到13.3%，出现频率与丰度超过热原体目（98/177，6.5%）和其他热原菌群体（5/177，3.1%），这表明MBG-D古生菌是一种普遍存在的沉积古菌，具有重要的生态意义。对MBG-D古菌进行主坐标分析（PCoA）排序，以寻找特定亚群与特定环境条件之间的联系。结果表明，盐度、生境（也与盐度有关）和渗漏条件对MBG-D古菌的分布有很大影响（图2c）。
图2 线性回归、主成分分析和共现网络图
3. 沉积物MBG-D古菌的共现网络
共现网络描绘了不同模块(图2d)和不同古菌类群(图2e)的节点之间的相关性，将属于Thermoprofundales亚群的节点在网络中突出显示(图2f)。MBG-D古菌在观测网络中是第四高丰度节点（15.03%），出现在6个主要模块中的4个。共现结果表明，Lokiarchaeota与MBG-D古菌具有最高的非随机关联。同时，Hadesarchaea也显示出与MBG-D古生物在网络中的显著非随机关联（图2e）。这种关系可能是生态位重叠的结果，而不是协同/协作的关系。然而，与Lokiarchaeota一样，这些关联存在于包含这两个谱系的所有模块中（图2d，e），并且非盐水和盐水来源的两个MBG-D古菌亚群（图2f）也与Lokiarchaeota关联，这可能说明MBG-D和Lokiarchaeota之间潜在的协同/协作关系。
4. Thermoprofundales (MBG-D)的基因组学特征
本研究中获得4个MBG-D古菌基因组（M11B2D，M8B2D，M9B1D，M9B2D），完整度大于75%，且与数据库中其他已知MBG-D古菌基因组相比，完整性高，污染少，菌株异质性低（表1）。其次，43个串联的标记基因（图3a）和16S rRNA基因（图3b）的系统发育分析证实了MBG-D古菌在广古菌门热原体纲中的位置。基于以上基因组特征和MBG-D古菌的系统发育，我们提出该未培养古菌类群作为新的古菌目，Thermoprofundales。
表1 Thermoprofundales MAG的基因组统计
图3 将Thermoprofundales置于热源体纲中的系统发育树
5. 生物地球化学作用和代谢概述
基因组学研究表明，Thermoprofundales可以有效利用蛋白质进行生物合成和细胞活性，但缺乏运输和吸收碳水化合物的途径。尽管低聚糖可能不会被Thermoprofundales直接利用，但它们可以被其他异养菌利用，生成中间产物，然后被Thermoprofundales利用。根据上述的基因组学研究，本研究样品中Thermoprofundales的丰度占古菌群落32%，能够促进有机质，特别是碎屑蛋白的周转，与其他微生物异养菌一起循环、保存营养物种，同时维持微生物-营养物-植物关系。
研究同时预测到Thermoprofundales蛋白质再矿化和通过WL途径或二羧酸/4-羟基丁酸循环固定CO2的潜力，认为Thermoprofundales的全球分布可能是由于它们的混合营养生活方式导致的。除此之外，它们似乎还具有从硫酸盐或蛋白质衍生的硫化合物中吸收硫的能力。这种代谢能力可能使Thermoprofundales能够有效地适应各种碳底物条件的底栖沉积物环境，特别是在能量有限的深层地下。Thermoprofundales可以产生乙酸和乙醇，随后为异养微生物和裂解性产甲烷菌提供小分子底物。产酸作用是底栖生物利用有机底物最有利的代谢途径，因此Thermoprofundales可以作为底栖生物环境中有效的有机质转化器。
图4 基于8个MAG重建的Thermoprofundales关键代谢途径
6. 转录模式
转录组数据结果表明，乙酸、氨基酸利用和肽转运等关键基因都处于高表达水平，证实了宏基因组分析所推测的代谢特性。WL途径、EMP途径和能量储存的基因也高度表达，这表明Thermoprofundales中与细胞功能和构建细胞结构相关的途径也是非常活跃。细胞外和细胞内肽酶，包括C01A、C14B、C25、M09B等，在这些MAG中均有表达。特别地，M09B（胶原酶）作为Thermoprofundales中最丰富的细胞外肽酶之一，也在所有四种红树林MAG中高表达（TPM范围从3793.3到50740.9）。胶原是构成动物细胞外基质最丰富、最普遍的材料，动物总蛋白的近30％由胶原蛋白组成。这表明，细胞外胶原水解蛋白酶降解不同环境细菌的胶原蛋白是释放固定氮（如动物尸体内的）进入全球氮循环的重要生物学过程。Thermoprofundales中胶原酶的高表达表明它们在全球沉积物中利用碎屑蛋白的作用。
表2 该研究MAG中转录水平的蛋白质
供稿 | 谭莎
编辑 | 王宇苑
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